原位杂交第三天
1） 用1ml含10％热灭清的mabt溶液置换溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlmabt置换，25分钟，再用1mlmabt溶液置换，一小时以上，原位杂交技术，后用1mlmabt溶液置换，植物原位杂交，25分钟。
2） 用1ml 1mm左旋米睉的staining buffer洗三次，每次放置五分钟。
3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul bm purple ap substrate(底物，用之前加5mm左旋米唑)，十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。
4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色
5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用pbst洗两三次后加上4％---固定，拍照。
6）4c冰箱保存。
一. 原位杂交天
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的pbst溶液，原位杂交，放置5分钟。
2） 置换成30％的pbst溶液，放置5分钟
3） 置换成pbst溶液，放置5分钟，重复一次
4） 置换成4％---的pbs溶液固定20分钟
5） 用pbst洗两次，每次放置五分钟，室温。
蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）
1） 用10ul/ml的蛋白酶k在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，荧光原位杂交，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。
2） 用pbst溶液轻洗，在pbst中放置5分钟。
3） 用4％---的pbs溶液固定20分钟，室温。
4） 用pbst洗两次，每次放置五分钟，室温。
原位杂交法是指将特定标记的已知顺序---为探针与细胞或组织切片中---进行杂交，从而对特定---顺序进行定量定位的方法。原位杂交法可以在细胞标本或组织标本上进行。另有荧光原位杂交使用dna或者rna探针来检测与其互补的另一条链在---或其他真核细胞中的位置rna原位---杂交又称rna原位杂交组织化学或rna原位杂交。
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