湖北植物启动子筛选-贝科新肽科技公司

为什么不先对基因做预测，在预测的结果上直接做共定位？

不同的预测网站有不同的计算方法，同一个基因在不同的预测网站也可能得出不同的定位结果。另外所有的结果都应是基于实验得到的，对于不清楚可能定位在哪里的基因，一般先做普通定位，根据普通定位的结果再决定做哪种细胞器的共定位。

适用于什么实验场景？

（1）基因功能研究，文章里总少不了这一项。

（2）研究蛋白相互作用，与酵母双杂实验结果相互验证。

亚细胞定位操作步骤

1、通过一些在线网站预测亚细胞定位

2、亚细胞定位载体构建

（1）引物设计：利用引物设计软件，根据pegp-mcs-n1或pegp-c1-mcs的酶切位点设计目的基因引物。

（2）载体构建：将pcr产物酶切后插入pegp-mcs-n1或pef-c1-mcs，得到表达目的基因与egp融合蛋白质的真核表达载体。

3、细胞转染

当细胞生长到对数生长期时，接种到共---显微镜的玻璃底培养皿（35mm petri dish，10 mm microwell）中，培养过夜。当细胞贴壁率达到30%~50%时，将融合绿色荧光蛋白gfp的重组载体质粒和目标细胞器质粒共转染细胞。37℃孵箱培养24~72h。

4、激光扫描共---显微镜观察

将上述细胞分别在24、36、48、72h的时间点，根据实验需求选择对应激发波长（常用405nm、488nm和561nm），使用共---显微镜观察，采取图像。