






构建亚细胞定位载体时,gfp融合位置为什么有n端、c端之分?
若序列中存在信号肽,则构建载体时需避开这一端来融合荧光蛋白。需注意不同的融合方式可能会得到不同的定位结果,例如融合在荧光蛋白n端的目标蛋白一般无法得到---化物酶体的定位结果;融合在荧光蛋白c端的目标蛋白一般无法得到线粒体、质体的定位结果。

为什么不同的受体材料有时得到的定位结果不一样?
不同物种的细胞在翻译表达基因时,其表达模式和影响因子不同。受物种差异的影响,双分子荧光互补技术,同一个载体在不同的受体材料中表达的位置可能不同,因此建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。
亚细胞定位是指在细胞内定位蛋白质、基因或其它分子元件的过程。通过亚细胞定位,可以了解这些物质在细胞中的具---置、作用和相互关系。在植物细胞中,亚细胞结构包括细胞核、线粒体、叶绿体、质膜、细胞壁等。通过对洋葱细胞的亚细胞定位,可以揭示洋葱中生物活性物质在各个亚细胞结构中的分布情况。
洋葱的亚细胞定位通常采用荧光技术或绿色荧光蛋白标记技术。荧光技术是一种基于抗原-反应的定位技术,通过标记特---,将目标物质与荧光标记结合,从而对其进行定位。绿色荧光蛋白标记技术则是一种将目标基因与绿色荧光蛋白基因融合,通过观察绿色荧光蛋白的表达情况来定位目标基因的技术。

直接法
将标记的特---荧光,直接加在抗原标本上,经一定的温度和时间的染色,用水洗去未参加反应的多余荧光,室温下干燥后封片、镜检。
间接法
如检查未知抗原,先用已知未标记的特异()与抗原标本进行反应,用水洗去未反应的,再用标记的抗(第二)与抗原标本反应,使之形成—抗原—复合物,再用水洗去未反应的标记,干燥、封片后镜检。如果检查未知,则表明抗原标本是已知的,待检为,其它步骤的抗原检查相同。

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