原位杂交第三天
1） 用1ml含10％热灭清的mabt溶液置换溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlmabt置换，25分钟，再用1mlmabt溶液置换，一小时以上，后用1mlmabt溶液置换，25分钟。
2） 用1ml 1mm左旋米睉的staining buffer洗三次，每次放置五分钟。
3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul bm purple ap substrate(底物，用之前加5mm左旋米唑)，十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。
4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色
5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用pbst洗两三次后加上4％---固定，gish，拍照。
6）4c冰箱保存。
原位杂交技术的技术流程
原位杂交技术的技术流程包括样本处理、探针制备、杂交反应和信号检测等步骤。样本处理包括组织或细胞的固定、包埋、切片和脱氧核糖---酶---等步骤，目的是保持组织或细胞的原始结构和---序列的完整性。探针制备包括标记探针、纯化和变性等步骤，目的是提高探针的特---和敏感性。杂交反应包括预杂交、杂交和洗脱等步骤，目的是使探针与目标---序列形成双链复合物。信号检测包括显色反应、荧光染色和性同位素标记等步骤，目的是可视化目标---序列的分布。
原位杂交第二天
1.
1）将探针回收，放于－20c保存(通常探针可重复使用十次左右)。
2）加入50%---胺/2xssct溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。
3）置换2xssct1ml，60℃，放置15分钟。
4）置换0.2xssct1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。
2.
1）用mabt洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。
2）室温下加1ml 1：2：7溶液，时间为一小时。
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶连，4c 冰箱过夜。
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