






构建亚细胞定位载体时,gfp融合位置为什么有n端、c端之分?
若序列中存在信号肽,则构建载体时需避开这一端来融合荧光蛋白。需注意不同的融合方式可能会得到不同的定位结果,例如融合在荧光蛋白n端的目标蛋白一般无法得到---化物酶体的定位结果;融合在荧光蛋白c端的目标蛋白一般无法得到线粒体、质体的定位结果。

为什么不同的受体材料有时得到的定位结果不一样?
不同物种的细胞在翻译表达基因时,其表达模式和影响因子不同。受物种差异的影响,双分子荧光互补技术,同一个载体在不同的受体材料中表达的位置可能不同,因此建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。
内质网
内质网是细胞中的一个复杂网络,它负责合成和转运蛋白质。为了定位内质网,我们可以使用一种名为gfp-hdel的蛋白质来标记它们。gfp-hdel是一种带有绿色荧光的蛋白质,它可以与内质网上的hdel序列结合。在洋葱细胞中,内质网通常位于细胞的中央或周围。
高尔基体
高尔基体是细胞中的另一个复杂网络,它负责合成和转运蛋白质。为了定位高尔基体,我们可以使用一种名为fm4-64的化合物来标记它们。fm4-64可以穿过细胞膜并进入高尔基体,从而发出红色荧光。在洋葱细胞中高尔基体通常位于细胞的中央或周围。
gfp是绿色荧光蛋白,在扫描共---显微镜的激光照射下会发出绿色荧光,从而可以地定位蛋白质的位置。绿色萤光蛋白(gfp)是一个由约238个---酸组成的蛋白质,从蓝光到紫外线都能使其激发,发出绿色荧光。通过基因工程技术,绿色萤光蛋白(gfp)基因能转进不同物种的基因组,在后代中持续表达,并且能根据启动子特---地表达。
使用gfp必须构建融合蛋白载体,并在转染之后有效表达。这样,若在荧光显微镜下看到细胞内某一部位存在gfp信号,说明和gfp融合的蛋白也存在于该部位,这样就达到了确定某物质亚细胞定位的目的。
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