动物组织原位杂交-贝科新肽-原位杂交

一. 原位杂交天

1. 重新水化和固定

1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的pbst溶液，放置5分钟。

2） 置换成30％的pbst溶液，放置5分钟

3） 置换成pbst溶液，放置5分钟，重复一次

4） 置换成4％---的pbs溶液固定20分钟

5） 用pbst洗两次，原位杂交公司，每次放置五分钟，室温。

 蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）

1） 用10ul/ml的蛋白酶k在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

2） 用pbst溶液轻洗，在pbst中放置5分钟。

3） 用4％---的pbs溶液固定20分钟，室温。

4） 用pbst洗两次，每次放置五分钟，室温。

原位杂交杂交液

（一）杂交液内除含一定浓度的标记探针外，原位杂交试剂，还含有较高浓度的盐类、---胺、---葡聚糖、牛白蛋白及载体dna或rna等。

（二）杂交液中含有较高浓度的na+可使杂交率增加，可以减低探针与组织标本之间的静电结合。

（三）贾---可使杂交温度降低，原位杂交，所以杂交液中加入适量的---胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。

（四）---葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的。

在研究dna分子原理的基础上发展起来的一种技术。其基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，动物组织原位杂交，能过氢键结合，形成dna-dna、dna-rna或 rna-rna 双键分子的特点，应用带有标记的（有性同位素，如3h、35s、32p、荧光素生物素、等非性物质）dna或rn---段作为---探针，与组织切片或细胞内待测---（rna或dna）片段进行杂交，然后可用自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mrna或dna 的存在并定位





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