






dna 探针为原位杂交提供较高的灵敏度。与rna探针相比,dna探针与靶mrna 分子的杂交强度较弱,动物组织原位杂交,因此在杂交后的洗涤中不应使用甲醛。
探针特------。如果已知细胞中mrna或dna的确切核苷酸序列,荧光原位杂交,则可据此设计高度的互补探针。如果超过 5% 的碱基对不互补,那么探针只能与靶序列发生轻度杂交。这意味着,探针更容易在洗涤和检测步骤中被洗去,可能无---确检测。
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,fish)技术是在已有的性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非性dna分子原位杂交技术。它利用荧光标记的---片段为探针,与染色体上或dna显微切片上的特异fl-n:~行杂交,通过荧光检测系统(荧光显微镜)检测信号dna序列在染色体或dna显微切片上的目的dna序列,进而确定其杂交位点。fish技术检测时间短,原位杂交,检测灵敏度高,原位杂交技术,无污染,已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。

以菌落原位杂交为例:对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(100-200)进行筛选时,可采用该方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张纤维素滤膜上。经培养一段时间后,对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
将少数菌落转移到纤维素滤膜上
(1) 在含有选择性的琼脂平板上放一张纤维素滤膜。
(2) 用无菌---将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。后,在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的---菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。
(4) 用已装防水黑色绘图墨水的针头穿透滤膜直至琼脂,在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。
(5) 用parafilm膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。
(6) 裂解---,按本段下面所述方法,使释放的dna结合于纤维素滤膜。

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